ग्राम दाग नींव, सामग्री, तकनीक और उपयोग

ग्राम का दाग नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान में सबसे सरल और सबसे उपयोगी धुंधला तकनीक है। यह तकनीक 1884 में डेनिश डॉक्टर हंस क्रिश्चियन ग्राम द्वारा बनाई गई थी, जो सेल की दीवार के अनुसार ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक में बैक्टीरिया को वर्गीकृत करने में कामयाब रहे।.

1921 में रिएक्टरों को स्थिर करने और दाग की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए तकनीक ने कुछ संशोधनों के तहत कुछ संशोधनों को रेखांकित किया, ताकि ग्राम दाग को ग्राम-हकर के रूप में भी जाना जाता है.

इस तकनीक के साथ सूक्ष्मजीवों के उस रूप का निरीक्षण करना भी संभव है, जो कि वे कोकोसी, बेसिली, कोकोबैसिली, प्लेमॉर्फिक, फिलामेंटस, अन्य हैं। अंतरिक्ष में इसके वितरण के साथ-साथ: क्लस्टर में, श्रृंखला में, अलग-थलग, जोड़े में, टेट्राड्स आदि में।.

जब एक जीवाणु संक्रमण का संदेह होता है, तो प्राप्त किए गए अधिकांश नमूनों को एक स्लाइड पर फैलाया जाना चाहिए और माइक्रोस्कोप के तहत जांच के लिए ग्राम के साथ दाग दिया जाना चाहिए।.

ग्राम की रिपोर्ट डॉक्टर को मार्गदर्शन करेगी कि फसल का अंतिम परिणाम प्राप्त करने से पहले सूक्ष्मजीव किस प्रकार के संक्रमण का कारण हो सकता है।.

कुछ मामलों में रोगी के जीवन में बहुत समझौता होता है, इसलिए डॉक्टरों को सूक्ष्मजीव की पहचान की प्रतीक्षा करते हुए एक अनुभवजन्य उपचार की आवश्यकता के लिए ग्राम रिपोर्ट की आवश्यकता होती है.

उदाहरण के लिए, अगर ग्राम से पता चलता है कि मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ में ग्राम पॉजिटिव कोक्सी है, तो डॉक्टर इस के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार, इस तरह के बैक्टीरिया को खत्म करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रारंभिक चिकित्सा को उन्मुख करेगा।.

एक बार अंतिम परिणाम अलग-थलग सूक्ष्मजीव और उसके संबंधित एंटीबायोग्राम के नाम के साथ आता है, तो चिकित्सक चिकित्सा को बदलने या न करने के लिए मूल्यांकन करेगा। यह निर्णय एंटीबायोटिक्स को सूक्ष्मजीव की संवेदनशीलता के अध्ययन के अनुसार किया जाएगा जो इसे प्राप्त कर रहा है और रोगी का विकास.

सूची

• 1 फाउंडेशन
• 2 सामग्री
• 3 रंजक और अभिकर्मकों की तैयारी
  • 3.1 क्रिस्टल वायलेट समाधान
  • ३.२ आयोडो-लुगोल
  • ३.३ विरंजन
  • ३.४ विपरीत
• 4 अभिकर्मकों का संग्रहण
• 5 रंगीन होने के लिए नमूने के प्रसार की तैयारी
  • ५.१ -ग्राम प्रत्यक्ष नमूनों की
  • ५.२ -ग्राम फसलों की
• 6 तकनीक
• 7 उपयोगिता
• 8 आम गलतियाँ
• 9 संदर्भ

आधार

यह एक तकनीक है जो 4 मौलिक चरणों को प्रस्तुत करती है: धुंधला हो जाना, निंदा के साथ निर्धारण, मलिनकिरण और अंतर्विरोध। इसलिए, यह तकनीक बैक्टीरिया को रंग देने के अलावा, उन्हें अलग भी करती है.

क्रिस्टल वायलेट पहला रंगीन प्रयोग किया जाता है। इसमें पेप्टिडोग्लाइकन के लिए एक आत्मीयता है और बैंगनी उपस्थित सभी बैक्टीरिया को दाग देगा, फिर लुगोल को रखा गया है, जो एक मोर्डेंट के रूप में कार्य करता है, अर्थात यह सेल के अंदर क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन - राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन के अघुलनशील परिसरों के निर्माण को प्रेरित करेगा।.

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया, पेप्टिडोग्लाइकन की मोटी दीवार वाले, अधिक जटिल (क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन) बनाते हैं, इसलिए वे डाई को बनाए रखते हैं.

यह भी प्रभावित करता है कि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की दीवार में अधिक मात्रा में असंतृप्त एसिड होते हैं, जो ऑक्सीकरण एजेंटों (लुगोल) के लिए एक उच्च संबंध दिखाते हैं.

इस बीच, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में पेप्टिडोग्लाइकेन की एक पतली परत होती है, जो बैक्टीरिया को ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया की तुलना में कम जटिल बनाती है.

इसके बाद मलिनकिरण का कदम आता है, जहां ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया अलग तरह से व्यवहार करते हैं.

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में एक बाहरी झिल्ली होती है जो लिपोपॉलीसेकेराइड से समृद्ध होती है जो इसकी कोशिका भित्ति का हिस्सा होती है। अल्कोहल एसीटोन के संपर्क से वसा नष्ट हो जाती है, इसलिए बाहरी झिल्ली को अस्थिर किया जाता है, वायलेट क्रिस्टल को छोड़ा जा रहा है.

यह तब है, जब इसे लाल रंग में लेते हुए सफारी या बेसिक फुकसिन से मुकाबला किया जाता है.

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के मामले में, वे मलिनकिरण का विरोध करते हैं क्योंकि ब्लीच छिद्रों को बंद करने का कार्य करता है, जो क्रिस्टल वायलेट / आयोडीन कॉम्प्लेक्स को भागने से रोकता है.

इसलिए, वायलेट क्रिस्टल के साथ रंग स्थिर है, और सफारी या फुकसिन के लिए कोई जगह नहीं है। इस वजह से, ये बैक्टीरिया गहरे नीले या बैंगनी रंग का दाग लगाते हैं.

सामग्री

ग्राम रंग सेट में निम्नलिखित शामिल हैं:

• वायलेट क्रिस्टल
• Lugol
• एसीटोन अल्कोहल
• सफ़रिन या बुनियादी फ़ुचिन

रंजक और अभिकर्मकों की तैयारी

क्रिस्टल वायलेट समाधान

समाधान A:

वायलेट क्रिस्टल -2 जीआर

एथिल अल्कोहल 95% -20cc

समाधान बी:

अमोनियम ऑक्सालेट -0.8 जीआर

आसुत जल -80 cc

वायलेट क्रिस्टल की अंतिम तैयारी के लिए, 1:10 घोल को आसुत जल से पतला होना चाहिए और घोल के 4 भागों के साथ मिश्रित करना चाहिए। मिश्रण को उपयोग करने से पहले 24 घंटे तक संग्रहीत किया जाता है। यह एक पेपर फिल्टर का उपयोग करके एम्बर धुंधला के लिए एक फ्लास्क में फ़िल्टर किया जाता है.

दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को ड्रॉपर के साथ एम्बर बोतल में स्थानांतरित किया जाता है.

Iodo-Lugol

निम्न प्रकार से प्रत्येक यौगिक की संकेतित मात्रा को मापें और मापें:

Iodo - 1gr के क्रिस्टल

पोटेशियम आयोडाइड - 2gr

आसुत जल -300 cc

पोटेशियम आयोडाइड पानी में थोड़ा कम घुलता है और फिर आयोडीन मिलाया जाता है। समाधान एक एम्बर रंग की बोतल में मुंडा है.

दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को ड्रॉपर के साथ एक छोटी एम्बर बोतल में स्थानांतरित किया जाता है.

सफेद करना

95% एथिल अल्कोहल -50 मिली

एसीटोन - 50 मिली

इसे बराबर भागों में तैयार किया जाता है। अच्छी तरह से कवर करें, यह वाष्पित हो जाता है.

ड्रॉपर के साथ एक बोतल में रखें.

यह तैयारी मध्यम समय 5-10 सेकंड में एक मलिनकिरण प्रदान करती है और सबसे अधिक अनुशंसित है.

शुरुआती केवल 95% एथिल अल्कोहल का उपयोग करना पसंद करते हैं, जहां मलिनकिरण 10 से 30 सेकंड तक धीमा है.

जबकि सबसे अनुभवी शुद्ध एसीटोन का उपयोग कर सकता है, जहां 1 से 5 सेकंड तक मलिनकिरण बहुत जल्दी होता है.

विरोध

Safranin स्टॉक समाधान

सफ्रिना -2.5 जीआर

एथिल अल्कोहल 95% -100 cc

100% एथिल अल्कोहल में 95% तक घुलने के बाद सफ़रिन की संकेतित मात्रा.

काम करने वाले सफारी समाधान स्टॉक समाधान से तैयार किया जाता है.

ऐसा करने के लिए, स्टॉक समाधान के 10 सीसी को मापें, 100 मिलीलीटर को पूरा करने के लिए आसुत जल का 90 सीसी जोड़ें.

एक एम्बर बोतल के साथ एक ड्रॉपर के साथ दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है.

सूक्ष्मजीव जो ग्राम-हकर के दाग के साथ कमजोर रूप से ग्राम-नकारात्मक को दागते हैं, जैसे कि कुछ एनारोबेस, लेगियोनेला एसपी, कैम्पिलोबैक्टर एसपी और ब्रुसेला एसपी, यदि कोपेलॉफ द्वारा ग्राम-हकर धुंधला, जिसे ग्राम-कोपेलोफ दाग कहा जाता है, का उपयोग किया जाता है, तो वे बहुत बेहतर रूप से दागदार हो सकते हैं।.

यह तकनीक बेसिक फुकसिन द्वारा सफारी डाई को बदलती है। इस संशोधन के साथ उपरोक्त सूक्ष्मजीवों को प्रभावी ढंग से रंगना संभव है.

अभिकर्मकों का भंडारण

तैयार रंगों को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाना चाहिए.

नमूने की तैयारी रंग में फैल गई

एक नमूने में कम से कम 10 होना चाहिए⁵ एक धब्बा में सूक्ष्मजीव के अवलोकन से पहले सूक्ष्मजीवों की संभावना है। ठोस या तरल मीडिया में स्प्रेड को प्रत्यक्ष नमूने या संस्कृतियों से बनाया जा सकता है.

स्प्रैड समान होना चाहिए, अच्छी तरह से वितरित और बहुत मोटी नहीं, मौजूद संरचनाओं के बेहतर दृश्य के लिए.

-प्रत्यक्ष नमूने के ग्राम

अपकेंद्रित्र के बिना मूत्र चना

मूत्र मिलाया जाता है और एक स्लाइड पर 10 μl रखा जाता है। कम से कम एक जीवाणु / विसर्जन क्षेत्र का अवलोकन यह दर्शाता है कि संक्रमण है.

इसका मतलब है कि संस्कृति में लगभग 100,000 से अधिक सीएफयू / एमएल (10) होंगे⁵ 85% मामलों में मूत्र का CFU / mL).

यह विधि 100,000 CFU से नीचे कॉलोनी की गणना के लिए उपयोगी नहीं है.

LCR ग्राम

सीएसएफ को सेंट्रीफ्यूग किया जाना चाहिए, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया और एक स्लाइड पर गोली फैल गई। यह तरल सामान्य परिस्थितियों में बाँझ है; बैक्टीरिया का अवलोकन संक्रमण को इंगित करता है.

सांस के नमूनों का ग्राम

थूक ग्राम, ब्रोन्कियल या ब्रोन्कोएलेवल लैवेज, हालांकि सूक्ष्मजीवों की एक किस्म हो सकती है, हमेशा निदान में मार्गदर्शन करेंगे, इसके अलावा उपयोगी कोशिकाओं के प्रकार भी देखे जा सकते हैं।.

थूक के मामले में, स्मीयर को नमूने के सबसे शुद्ध भागों के साथ तैयार किया जाना चाहिए.

मल ग्राम

इस प्रकार के नमूनों में ग्राम प्रदर्शन करने की अनुशंसा नहीं की जाती है, क्योंकि इसका कोई नैदानिक ​​मूल्य नहीं है.

-चने की फसल

उन्हें दो तरीकों से किया जा सकता है, एक तरल फसलों से और दूसरा ठोस फसलों से.

तरल फसलें

तरल संस्कृतियों से यह अत्यंत सरल है; लाइटर के नीचे टर्बिड शोरबा के कई रोस्टों को लिया जाता है और उन्हें एक साफ और सूखी स्लाइड पर रखा जाता है, जिससे केंद्र से परिधि की ओर परिपत्र गति दी जाती है, ताकि सामग्री को समान रूप से वितरित किया जा सके.

इसे अनायास हवा में सूखने दिया जाता है। एक बार सूखने पर, सामग्री को गर्मी के साथ शीट पर तय किया जाता है। इसके लिए, एक क्लैंप की मदद से, शीट 3 को बन्सन बर्नर की लौ के माध्यम से 4 बार पारित किया जाता है, इस बात का ख्याल रखते हुए कि सामग्री को न जलाएं.

शीट को ठंडा करने और रंग पुल पर रखने की अनुमति है.

ठोस फसल

एक ठोस संस्कृति से ग्राम दाग के लिए एक विस्तार करने के लिए, निम्नानुसार आगे बढ़ें:

कॉलोनियों को चुनने से पहले, स्लाइड को तैयार किया जाना चाहिए, जिसमें बाँझ शारीरिक खारा समाधान के लगभग दो बूंद होते हैं.

यदि मूल संस्कृति प्लेट में कई अलग-अलग प्रकार की कॉलोनियां होती हैं, तो ग्राम को निष्पादित करने के लिए प्रत्येक की एक अलग कॉलोनी को चुना जाएगा। प्रत्येक कॉलोनी को प्लैटिनम लूप के साथ लिया जाएगा ताकि इसे स्लाइड पर पहले से रखे खारे घोल में मिलाया जा सके.

स्लाइड पर कॉलोनी को सजातीय रूप से वितरित करने के लिए, केंद्र से परिधि तक परिपत्र गति दी जाती है।.

इसे अनायास हवा में सूखने दिया जाता है। एक बार शीट को गर्मी से सुखाया जाता है, जैसा कि ऊपर बताया गया है (स्लाइड को लाइटर से जलाते हुए), ध्यान रहे कि सामग्री को न जलाएं.

यह प्रक्रिया प्रत्येक भिन्न प्रकार की कॉलोनी के साथ की जानी चाहिए। कागज के एक टुकड़े पर, उदाहरण के लिए नोट किया जाना चाहिए:

कॉलोनी 1: पीले बीटा-हेमोलिटिक कॉलोनी: ग्राम-पॉजिटिव कोक्सी समूहों में देखे गए थे

कॉलोनी 2: क्रीम कॉलोनी, हेमोलिसिस के बिना: ग्राम नकारात्मक कॉकोबासिली मनाया गया.

प्रत्येक पत्रक को यह जानने के लिए लेबल किया जाना चाहिए कि हम क्या देख रहे हैं.

तकनीक

ग्राम धुंधला तकनीक प्रदर्शन करने के लिए बेहद सरल है और अपेक्षाकृत सस्ती है और एक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में याद नहीं किया जा सकता है.

निम्नानुसार किया जाता है:

1. गर्मी के साथ धब्बा को ठीक करें और रंगीन पुल पर रखें.
2. शीट 1 मिनट के लिए पूरी तरह से वायलेट ग्लास से ढकी हुई है.
3. पानी से धो लें। सूखा नहीं
4. लुगोल समाधान के साथ प्लेट को कवर करें, 1 मिनट के लिए छोड़ दें। पानी से धो लें। सूखा नहीं.
5. एसीटोन अल्कोहल में कोमल आंदोलन के साथ 5-10 सेकंड के लिए ब्लेंड करें। या शीट को एक ईमानदार स्थिति में रखें और सतह पर आने वाले विघटित एजेंट की बूंदों को तब तक छोड़ दें जब तक कि शेष वायलेट ग्लास को खींच नहीं लिया जाता है। से अधिक न हो.
6. पानी से धो लें। सूखा नहीं.
7. रंगीन पुल पर शीट बदलें और सफारी (ग्राम-हकर) के साथ 30 सेकंड के लिए कवर करें या 1 मिनट मूल फुकसिन (ग्राम-कोपेलॉफ़) के साथ कवर करें.
8. पानी से धो लें
9. ऊर्ध्वाधर हवा में अनायास सूखने की अनुमति दें.

एक बार सूख जाने के बाद, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में 100X के उद्देश्य के तहत इसे डुबोने के लिए 1 बूंद तेल रखें.

उपयोगिता

यह तकनीक अधिकांश बैक्टीरिया के रूप-प्रकार के अंतर को अलग करने की अनुमति देती है.

खमीर भी इस रंग से प्रतिष्ठित हैं। वे क्रिस्टल वायलेट लेते हैं, यानी वे ग्राम पॉजिटिव को दाग देते हैं.

दूसरी ओर, ग्राम पॉजिटिव बीजाणु-गठन बेसिली को प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जिसमें बेसिलस के अंदर एक स्पष्ट स्थान मनाया जाता है, जहां एंडोस्पोर का गठन किया गया था, हालांकि बीजाणु अच्छी तरह से दाग नहीं करते हैं। बीजाणुओं का उपयोग करने के लिए, Shaeffer-Fulton जैसी अन्य तकनीकों का उपयोग किया जाता है.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह दाग सभी प्रकार के जीवाणुओं को रंग देने के लिए काम नहीं करता है, अर्थात्, ऐसे मामले हैं जिनमें धुंधला काम नहीं करता है.

इस मामले में, सेल की दीवार की कमी वाले बैक्टीरिया का उल्लेख किया जा सकता है। उदाहरण के लिए: जीनस मायकोप्लाज्मा, स्फेरोप्लास्ट, यूरियाप्लाज्मा, एल-फॉर्म और प्रोटोप्लास्ट.

यह माइकोलिक एसिड से समृद्ध दीवारों जैसे माइकोबैक्टीरिया और इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया जैसे क्लैमाइडिया और रिकेट्सियास के साथ बुरी तरह से बैक्टीरिया को दाग देता है।.

अधिकांश स्पाइरोचेटल बैक्टीरिया को दागना भी अक्षम है.

एक ही जीन के बैक्टीरिया होते हैं जिन्हें ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक के समान नमूने में देखा जा सकता है। जब ऐसा होता है, तो इसे परिवर्तनशील ग्राम दाग कहा जाता है, जो पोषक तत्वों, तापमान, पीएच या इलेक्ट्रोलाइट्स की एकाग्रता में परिवर्तन के कारण हो सकता है।.

सामान्य गलतियाँ

अत्यधिक ब्लीच करें

मलिनकिरण कदम में अतिरंजना झूठी ग्राम-नकारात्मक सूक्ष्मजीवों के अवलोकन का कारण बन सकती है.

विसर्जन तेल जोड़ने के लिए पर्याप्त सुखाने के समय का इंतजार न करें:

यह त्रुटि फैटी मिसेल के गठन का कारण बनती है जो उपस्थित संरचनाओं का निरीक्षण करना मुश्किल बनाती है। यह तब होता है जब तेल धब्बा में मौजूद पानी के अणुओं में शामिल हो जाता है.

अभिकर्मकों के क्रम को उल्टा करें:

इस तरह की एक त्रुटि ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को बैंगनी प्रदर्शित करने का कारण बनेगी, अर्थात् झूठी ग्राम-पॉजिटिव.

पुरानी फसलों (ठोस या तरल) का उपयोग करें:

यह ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया को ग्राम नकारात्मक (झूठे ग्राम नकारात्मक) दाग दे सकता है। ऐसा इसलिए होता है क्योंकि पुरानी संस्कृतियों में यह संभावना है कि मृत या खराब बैक्टीरिया हैं और इन परिस्थितियों में बैक्टीरिया वायलेट क्रिस्टल को बनाए नहीं रखते हैं.

बहुत पुराने लुगोल समाधान का उपयोग करें:

समय के साथ लुगोल अपने गुणों को खो देता है और इसका रंग फीका पड़ जाता है। यदि पहले से ही पतित अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है, तो यह क्रिस्टल वायलेट को अच्छी तरह से ठीक नहीं करेगा, इसलिए सूक्ष्मजीवों के एक दृश्य को प्राप्त करने की संभावना है झूठा ग्राम नकारात्मक.

नीले रंग की पृष्ठभूमि

एक उचित रूप से निराश पृष्ठभूमि लाल हो जाएगी। एक नीली पृष्ठभूमि इंगित करती है कि मलिनकिरण अपर्याप्त था.

संदर्भ

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