डीएनए अनुक्रमण मैक्सम-गिल्बर्ट, सेंगर विधि, उदाहरण

डीएनए अनुक्रमण (डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड) आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं में की जाने वाली एक प्रक्रिया है जो ब्याज की आनुवंशिक सामग्री में न्यूक्लियोटाइड के आदेश को जानने की अनुमति देती है। इसके अलावा, आरएनए (राइबोन्यूक्लिक एसिड) की अनुक्रमण भी प्रकट किया जा सकता है.

यह तकनीक जैविक विज्ञान के विकास के लिए अपरिहार्य है। यह ज्ञान के अन्य क्षेत्रों पर भी लागू होता है - जैसे चिकित्सा निदान और फोरेंसिक जांच, उदाहरण के लिए.

इससे पहले, डीएनए के एक स्ट्रैंड की अनुक्रमण को एक धीमी और महंगी गतिविधि माना जाता था, जिसने ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में केवल कुछ आधार जोड़े की पहचान की अनुमति दी थी.

आजकल, विज्ञान के सभी अग्रिमों के साथ, डीएनए अनुक्रमण इस क्षेत्र में लगभग 50 वर्षों के अनुसंधान के योगदान के लिए दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं में एक नियमित संचालन है। श्रृंखला की लंबाई के लिए, आप बहुत कम समय में लाखों बेस जोड़े तक अनुक्रम कर सकते हैं.

ऐसा करने के लिए, दर्जनों तकनीकें विकसित की गई हैं जो कीमत और सटीकता में भिन्न हैं। इस लेख में, हम शास्त्रीय और आधुनिक दोनों तकनीकों का वर्णन करेंगे, प्रत्येक इसके फायदे और नुकसान के साथ.

अब तक, अनुक्रमण तकनीकें छोटे जीनों और खमीरों से मानव जीनोम तक संपूर्ण जीनोम के अनुक्रम को प्राप्त करने की अनुमति देती हैं।.

सूची

• 1 डीएनए की संरचना
• 2 इतिहास
• 3 सेंगर विधि
  • 3.1 प्रतिक्रिया के मुख्य घटक
  • 3.2 परिणाम पढ़ना
• 4 स्वचालित अनुक्रमण
• 5 मैक्सम-गिल्बर्ट अनुक्रमण
  • ५.१ प्रक्रिया
  • 5.2 परिणाम पढ़ना
• 6 बड़े अनुक्रमण
  • ६.१ पैरोड्रेंसिंग
  • 6.2 संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण
  • 6.3 बंधाव द्वारा अनुक्रमण
  • 6.4 सीक्वेंसिंग आयन टोरेंट
• 7 उदाहरण
  • 7.1 मानव जीनोम का अनुक्रमण
• 8 महत्व और अनुप्रयोग
• 9 संदर्भ

डीएनए की संरचना

डीएनए अनुक्रमण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों और तकनीकों को समझने के लिए, अणु की संरचना और संरचना के कुछ प्रमुख पहलुओं को जानना आवश्यक है.

डीएनए जीवाणुओं से लेकर बड़े जलीय जंतुओं तक सभी जीवित चीजों में पाया जाने वाला एक बायोमोलेक्यूल है। ऑर्गेनेल - माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट की तरह - उनके अंदर एक गोलाकार डीएनए अणु होता है। यहां तक ​​कि कुछ विषाणुओं में पाया जाने वाला आनुवंशिक पदार्थ डीएनए है.

संरचनात्मक रूप से, डीएनए न्यूक्लियोटाइड का एक सेट है। प्रत्येक को एक कार्बोहाइड्रेट, एक नाइट्रोजनस बेस (ए, टी, सी या जी) और एक फॉस्फेट समूह द्वारा एकीकृत किया जाता है। डीएनए अनुक्रमण का लक्ष्य उस क्रम को प्रकट करना है जिसमें अनुक्रम में चार नाइट्रोजनस आधार पाए जाते हैं.

इतिहास

1950 के दशक के मध्य में, शोधकर्ताओं वॉटसन और क्रिक ने क्रिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके डीएनए की संरचना का वर्णन किया। हालांकि, इनमें से कोई भी शोधकर्ता अनुक्रम को उजागर करने का एक तरीका नहीं खोज पाया था.

हालाँकि कुछ पूर्ववर्ती थे, सबसे महत्वपूर्ण घटना थी, 1977 में सेंगर के तरीके का निर्माण। विधि के जनक फ्रेडरिक सेंगर एक ब्रिटिश जैव रसायनविद थे, जो जैविक विज्ञान में अपने महान योगदान के लिए दो नोबेल पुरस्कारों के विजेता थे।.

इस तकनीक को साहित्य में "चेन टर्मिनेशन" या डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में भी जाना जाता है। आगे हम इस तकनीक के सिद्धांतों और उन लोगों का वर्णन करेंगे जो इस के सुधार और नवाचार के आधार पर विकसित किए गए थे.

सेंगर की विधि

सेंगर की पद्धति के विकास ने आणविक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण घटना का प्रतिनिधित्व किया। इसमें डीएनए प्रतिकृति प्रक्रिया के मूल घटक शामिल होते हैं जो आम तौर पर कोशिका में होते हैं, लेकिन एक विशेष घटक को जोड़कर: dideoxynucleotides.

प्रतिक्रिया के मुख्य घटक

- डीएनए पोलीमरेज़: एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण तत्व है। यह अणु डीएनए स्ट्रैंड की प्रतिकृति में भाग लेता है और इसकी भूमिका नई श्रृंखला का संश्लेषण है, जो पूरक के साथ डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स ट्राइफॉस्फेट से मेल खाता है।.

याद रखें कि डीएनए में थाइमाइन (T) को दो हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से एडेनिन (A) के साथ जोड़ा जाता है, जबकि साइटोसिन (C) तीन पुलों द्वारा ग्वानिन (G) के साथ करता है।.

- न्यूक्लियोटाइड्स: सेंगर अनुक्रमण में दो प्रकार के न्यूक्लियोटाइड्स शामिल होते हैं, चार 2'-deoxynucleotides (संक्षिप्त रूप में dATP, dGTP, dCTP और dTTP) और चार dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP और ddTTP)।.

हालांकि डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स मोनोमर्स के समान होते हैं जो सामान्य रूप से डीएनए में शामिल होते हैं, उनकी संरचना में -OH समूह की कमी होती है। इससे श्रृंखला में एक नया न्यूक्लियोटाइड जोड़ना असंभव हो जाता है.

इसलिए, जब एक विशेष न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है - पूरी तरह से यादृच्छिक तरीके से - निर्माण में श्रृंखला के लिए, संश्लेषण को पंगु बना दिया जाता है। इस तरह, प्रतिक्रिया के अंत में, विभिन्न आकारों की श्रृंखलाएं होती हैं, प्रत्येक जहां एक अलग बिंदु पर प्रतिक्रिया रोक दी गई थी.

प्रयोगात्मक रूप से, चार परीक्षण तैयार किए जाते हैं। प्रत्येक में ब्याज के जैविक नमूने से निकाले गए डीएनए, सामान्य न्यूक्लियोटाइड और चार विशेष न्यूक्लियोटाइड में से एक होता है। या विशेष न्यूक्लियोटाइड्स को कुछ प्रकार के फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ चिह्नित किया जाता है (स्वचालित अनुक्रमण के नीचे देखें).

परिणामों का पढ़ना

पहला चरण संश्लेषित श्रृंखलाओं में से प्रत्येक को उनके आकार के अनुसार अलग करना है। कुछ अन्य की तुलना में अधिक लंबे होंगे, जहां पर विशेष ठिकानों को शामिल किया गया था.

विभिन्न जैव रासायनिक तकनीकें हैं जो एक विभेदक संपत्ति के रूप में आकार का उपयोग करके मिश्रण के घटकों को अलग करने की अनुमति देती हैं। सेंगर विधि में, विभिन्न श्रृंखलाओं को वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है। तकनीक के सबसे परिष्कृत रूपों में, केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाता है.

इस प्रकार, लंबे स्ट्रैंड्स छोटे वेरिएंट से कम चलते हैं। फिर, यह प्रणाली एक पाठक के माध्यम से जाती है जो प्रत्येक डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड में शामिल मार्कर को पहचानती है। इस तरह, अनुक्रम के क्रम को जाना जा सकता है.

यह "पहली पीढ़ी" तकनीक डीएनए के टुकड़ों को 1 किलोग्राम से अधिक नहीं पढ़ने में सक्षम है। वर्तमान में, सेंगर की पद्धति का उपयोग कई प्रयोगशालाओं में किया जाता है, आमतौर पर इसके आधुनिक रूप में। इसके अलावा, इसका उपयोग सबसे जटिल तकनीकों के साथ प्राप्त परिणामों को ठीक करने के लिए किया जाता है - लेकिन कम सटीक.

स्वचालित अनुक्रमण

जब बड़े पैमाने पर अनुक्रमण आवश्यक होता है, तो स्वचालन द्वारा प्रक्रिया को तेज किया जाता है। यह सेंगर श्रृंखला समाप्ति विधि का एक रूपांतर है, जहां प्राइमर को फ्लोरोसेंट उत्पादों के साथ चिह्नित किया जाता है ताकि उन्हें अलग किया जा सके.

इसके बाद, प्रतिक्रिया का उत्पाद एक वैद्युतकणसंचलन में चलाया जाता है - सभी एक ही लेन में। जब प्रत्येक टुकड़ा जेल के अंतिम भाग को छोड़ देता है, तो यह जल्दी से अपने फ्लोरोसेंट लेबल द्वारा पहचाना जाता है, एक त्रुटि के साथ जो 1% के आसपास होती है.

सबसे परिष्कृत प्रणालियों में एक रोबोट द्वारा युग्मित कंप्यूटर द्वारा संचालित 96 केशिका ट्यूब तक की एक प्रणाली है। यानी 96 डीएनए नमूनों का एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रकार, वैद्युतकणसंचलन और परिणामों के विश्लेषण से जुड़ी प्रक्रिया पूरी तरह से स्वचालित है.

एक दिन में, ये सिस्टम 550,000 ठिकानों तक पहुंच सकता है। प्रक्रिया के दौरान, मानव कार्य अनावश्यक है, विधि शुरू करने में केवल 15 मिनट लगते हैं.

मैक्सम-गिल्बर्ट द्वारा अनुक्रमण

उसी समय जब सेंगर ने अपना काम प्रकाशित किया, एलन मैक्सन और वाल्टर गिल्बर्ट नाम के दो शोधकर्ताओं ने डीएनए अनुक्रम प्राप्त करने के लिए एक और तरीका विकसित किया। इस पद्धति ने उस समय लोकप्रियता हासिल की, लेकिन बाद में सेंगर की पद्धति में सुधार के कारण विस्थापित हो गए.

सेंगर की पद्धति के विपरीत, मैक्सन और गिल्बर्ट की अनुक्रमण (या रासायनिक अनुक्रमण, जैसा कि यह भी ज्ञात है) संकरण प्रतिक्रियाओं में शामिल नहीं है। कार्यप्रणाली में एक छोर पर प्रतिक्रियाशील एजेंटों के साथ अंकन होता है, इसके बाद एक शुद्धिकरण प्रक्रिया होती है.

इस तकनीक के नकारात्मक पहलुओं में से एक इसकी विशाल जटिलता और रसायनों के उपयोग में निहित है जो उपयोगकर्ता के लिए खतरनाक हैं। रासायनिक विखंडन नमक के साथ डीएमएस, फॉर्मिक एसिड, हाइड्रेंजिन और हाइड्रैजाइन के अनुप्रयोग से प्रेरित होते हैं.

प्रक्रिया

प्रोटोकॉल फॉस्फर मार्कर 32 के साथ स्ट्रैंड के 5 'छोर पर लेबलिंग के साथ शुरू होता है, फिर नाइट्रोजन बेस का एक रासायनिक संशोधन होता है और इसे अलग किया जाता है। अंत में एबैसिक क्षेत्र का विभाजन होता है.

पहले श्रृंखला को अनुक्रमित करने के लिए छोटे खंडों में छोटा किया जाता है। यह कदम प्रतिबंध एंजाइमों के साथ किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बकाया चरम सीमा होती है.

अगला, प्रतिक्रिया एक क्षारीय फॉस्फेट के साथ की जाती है, जिसका उद्देश्य फॉस्फेट समूह को खत्म करना है। इस प्रकार, लेबलिंग करने के लिए एक पोलीन्यूक्लियोटाइड किनसे का उपयोग किया जा सकता है.

श्रृंखला को बदनाम किया जाता है (दो किस्में खुली)। फिर हम रसायनों को लागू करने के लिए आगे बढ़ते हैं। इन दरार प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित तरीके से किया जाता है और प्रत्येक रसायन द्वारा किस प्रकार के बंधन को तोड़ा जाता है.

परिणामों का पढ़ना

जैसा कि सेंगर विधि में, परिणामों को पढ़ने में एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में प्राप्त श्रृंखलाओं के आकार से अलगाव शामिल है। पॉलीएक्रिलामाइड से बना सिस्टम जेल को पढ़ने के लिए एक बहुत ही पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की अनुमति देता है.

बड़े पैमाने पर अनुक्रमण

बड़े पैमाने पर अनुक्रमण में अंग्रेजी से एनजीएस के रूप में संक्षिप्त उपन्यास विधियों की एक श्रृंखला शामिल है, "अगली पीढ़ी की सीक्वेंसिंग ".

एनजीएस के रूप में सूचीबद्ध तरीकों को डीएनए प्रवर्धन के पिछले चरण की आवश्यकता होती है (वे एक अणु के साथ काम नहीं करते हैं)। इसके अलावा, उपयोग किए गए प्लेटफ़ॉर्म व्यापक रूप से भिन्न होते हैं। सबसे लोकप्रिय तरीकों के सिद्धांतों को नीचे वर्णित किया जाएगा:

pyrosequencing

इसमें एक पाइरोफॉस्फेट की रिहाई की निगरानी करना शामिल है, जो हर बार डीएनए स्ट्रैंड में एक नया न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है। एक एंजाइम प्रणाली को युग्मित किया जाता है, ताकि हर बार एक नया न्यूक्लियोटाइड शामिल होने पर प्रकाश उत्सर्जन (जो कैमरे द्वारा पता लगाया जा सके) शामिल होता है.

इस प्रक्रिया की शुरुआत प्रत्येक नाइट्रोजनस बेस के अलग-अलग ऊष्मायन से होती है ताकि यह पता चल सके कि प्रकाश उत्सर्जन है या नहीं। पायरोफ्रेंसिंग लंबे स्ट्रैंड्स के रीडिंग को परफॉर्म कर सकती है, लेकिन इसमें पाया गया एरर रेट ज्यादा है.

संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण

इसमें लेबल न्यूक्लियोटाइड का समावेश शामिल है। इन फ्लोरोसेंट घटकों को जोड़ा जाता है, धोया जाता है और निगमित न्यूक्लियोटाइड नोट किया जाता है। फिर, न्यूक्लियोटाइड लेबलिंग को समाप्त कर दिया जाता है, और स्ट्रैंड का संश्लेषण जारी रह सकता है। अगले चरण में, एक लेबल न्यूक्लियोटाइड भी शामिल किया जाएगा, और उल्लिखित चरणों को दोहराया जाएगा.

इस तकनीक के साथ एक खामी तब होती है जब फ्लोरोसेंट मार्कर पूरी तरह से समाप्त नहीं होते हैं। ये उत्सर्जन पृष्ठभूमि त्रुटियों को बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण त्रुटियां होती हैं.

बंधाव द्वारा अनुक्रमण

यह तकनीक दूसरों से भिन्न है, क्योंकि यह डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग नहीं करता है। इसके बजाय, इस पद्धति के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम लिगेज है। यहां डीएनए टुकड़े का उपयोग फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया जाता है, एंजाइम द्वारा बाध्य होता है और इसका पता लगाया जाता है.

इस तकनीक के साथ सबसे बड़ी समस्या खंड की बहुत कम लंबाई है जो प्रसंस्करण में सक्षम है.

आयन अनुक्रमण टोरेंट

यह तकनीक एच आयन के माप पर आधारित है⁺ जिसे हर बार एक नया न्यूक्लियोटाइड शामिल किया जाता है। सिद्धांत काफी हद तक पाइरोडिंग के समान है, लेकिन बहुत सस्ता है.

उदाहरण

मानव जीनोम का अनुक्रमण

मनुष्यों के जीनोम को जीतना जीव विज्ञान में सबसे आशाजनक चुनौतियों में से एक रहा है, साथ ही विज्ञान के इतिहास में सबसे प्रशंसित प्रतिद्वंद्वियों में से एक है। वास्तव में, इस परियोजना में शामिल वैज्ञानिकों के लिए, जीनोम अनुक्रमण एक प्रतियोगिता बन गया.

1990 में उन्होंने "मानव जीनोम परियोजना" शुरू की, जिसे प्रसिद्ध वैज्ञानिक, नोबेल पुरस्कार के विजेता, जेम्स वाटसन ने नेतृत्व किया। एक साल बाद, 1991 में, वेंटर वॉटसन को "पिटाई" करने की चुनौती लेता है और उसके सामने जीनोम का अनुक्रमण करता है। हालांकि, वर्ष 1992 में वॉटसन सेवानिवृत्त हो गए और कमान एक अन्य शोधकर्ता ने संभाली.

1995 में वेंटर ने यादृच्छिक अनुक्रमण विधि द्वारा एक जीवाणु जीनोम के पूर्ण अनुक्रमण में अपनी सफलता की घोषणा की। इसी तरह, विपरीत टीम ने एक साल बाद खमीर जीनोम की अनुक्रमण की घोषणा की.

वर्ष 2000 में दौड़ को समाप्त कर दिया गया था। दोनों कंपनियों ने विज्ञान में सबसे प्रतिष्ठित पत्रिकाओं में से दो में पूर्ण जीनोम के अपने प्रारंभिक परिणाम प्रकाशित किए: प्रकृति और विज्ञान.

हालांकि, वैज्ञानिकों ने प्रस्तावों में सुधार करने के लिए काम करना जारी रखा, और 2006 में दृश्यों को कुछ मानव गुणसूत्रों को पूरा किया गया.

महत्व और अनुप्रयोग

एक अणु के न्यूक्लियोटाइड के क्रम को जानना उतना ही महत्वपूर्ण है जितना डीएनए जीवविज्ञानी और संबंधित पेशेवरों के लिए मूल्यवान है। पॉली न्यूक्लियोटाइड्स की इस श्रृंखला में सभी जीवन रूपों के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक सभी जानकारी शामिल है.

इन कारणों से, जैविक अनुसंधान के लिए इस अनुक्रम का ज्ञान आवश्यक है। मौलिक रूप से, अनुक्रमण हमें जैविक प्रणालियों के सबसे महत्वपूर्ण गुणों में से एक को मापने और उनके बीच अंतर स्थापित करने की अनुमति देता है.

सीक्वेंसिंग का व्यापक रूप से टैक्सोनोमिस्ट्स और सिस्टमैटिस्ट द्वारा उपयोग किया जाता है, क्योंकि कुछ डीएनए अनुक्रम यह निर्धारित करने के लिए मानदंड स्थापित करने की अनुमति देते हैं कि दो जीव एक ही प्रजाति के हैं या नहीं, साथ ही उन दोनों के बीच phylogenes संबंधों के बारे में परिकल्पना का प्रस्ताव करने में सक्षम है।.

इसके अलावा, डीएनए अनुक्रमण में चिकित्सा और निदान के क्षेत्र में अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, सस्ती और सुलभ प्रणालियां हैं, जो अनुक्रमण के माध्यम से, हमें तथाकथित सरल न्यूक्लियोटाइड पॉलीमॉर्फिज्म (एसएनपी) का उपयोग करके कुछ बीमारियों (जैसे कैंसर) के विकास की प्रवृत्ति का मूल्यांकन करने की अनुमति देती हैं।.

आपराधिक और फोरेंसिक प्रकार की जांच को भी अनुक्रमण की तकनीकों से समृद्ध किया गया है, और एक अपराध में एक निश्चित व्यक्ति की भागीदारी के विश्वसनीय सबूत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

संदर्भ

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